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舊的檢測試劑盒或受質試劑盒請改用新的檢測緩衝液。
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疊氮化鈉 (sodium azide) 抑制反應避免使用含疊氮化鈉的緩衝液,疊氮化鈉可能淬滅 HRP 信號。
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一抗的培育時間不足延長一抗的培育時間或在4℃下培育至隔夜。
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過度洗滌轉印膜請勿過度洗滌轉印膜-過度洗滌可能洗去一抗。嘗試洗滌 3 次,每次 5 分鐘。
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阻隔緩衝液(blocking buffer)脫脂牛奶可能掩蔽抗原。嘗試減少阻隔緩衝液和抗體溶液中的牛奶量,或用不同的阻隔緩衝液替代。
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轉印不完全將轉印條件(如時間、電流)最適化。實施下一個步驟之前,重新確認轉印程序是否完全。
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過度重複使用抗體請使用新鮮的抗體溶液以獲得最佳效果。
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使用不相容的二抗請使用在可抗一抗的宿主物種的二抗。使用陽性對照組以確保二抗可正常作用。
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一抗濃度不足使用更高的抗體濃度。我們的說明中提供了關於抗體稀釋的指南。使用陽性對照組以確保一抗可正常作用。
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存在難度較高的目標蛋白質嘗試使用最為靈敏的檢測試劑。
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上樣至凝膠內蛋白量不足提高蛋白上樣的樣本量,每個泳道使用 25-50 ug 細胞/組織裂解液蛋白。每個泳道至少上樣25 ug的細胞裂解液蛋白。
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蛋白質降解或被分解使用蛋白酶抑制劑以改善相關情況。
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不同的剪接變異體 (splice variant)搜索與目標蛋白質表現相關的資訊。
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蛋白質修飾搜索相關文件或使用某些可預測蛋白修飾的生物資訊工具。
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二抗濃度過高縮短培育時間或降低抗體濃度。將二抗上樣至膠上其中一個泳道,作為對照之用。
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曝光時間過度縮短曝光時間。
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洗滌不足增加 PBS 洗滌次數,以除去無用的殘餘抗體。
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阻隔時間不足延長阻隔時間或4℃下阻隔至隔夜。
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阻隔試劑和抗體間發生交叉反應在洗滌緩衝液中添加Tween 20(界面活性劑)或嘗試不同的阻隔液。
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抗體的非特異性結合延長阻隔培育時間。在阻隔液中添加5%脫脂奶粉和Tween 20。
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抗體濃度過高進一步稀釋抗體濃度或縮短培育時間。
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二抗不相容選擇可抗一抗宿主物種之 IgG 的二抗。
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抗體培育時間不足延長培育時間。
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用於蛋白檢測的抗體數量不足嘗試使用更高濃度的一抗並延長培育時間
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樣本中的目標蛋白數量不足查詢與目標蛋白之組織特異性相關的資訊。使用最為靈敏的檢測試劑。
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抗原被掩蔽使用適當的抗原回收方法,利用福馬林固定破壞已形成的蛋白交聯結構。
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脫蠟 (deparaffinization ) 不足更換二甲苯溶液並延長樣本脫蠟時間。
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組織中存在自發螢光或自然螢光與抗體一同培育前,先用螢光顯微鏡檢查組織切片。如偵測到螢光信號,則建議選擇其他檢測系統代替螢光法。
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內生性生物素 (biotin) 信號如使用生物素-抗生物素蛋白系統 (biotin-avidin detection system),請使用非結合抗生物素蛋白進行組織樣本之前處理。
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內生性鹼性磷酸酶 (alkaline phosphatase) 活性如使用 AP 進行標記,請用左旋咪唑溶液 (levamisole solution) 進行組織樣本之前處理。
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內生性過氧化酶 (peroxidase) 活性與一抗一同培育前,將組織樣品用3%過氧化氫進行前處理。
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二抗的非特異性結合將二抗單獨上樣至一個泳道以作為對照組。
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抗體濃度可能過高降低抗體濃度。
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阻隔時間不足延長阻隔時間或使用更多或不同的阻隔緩衝液。
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抗體濃度可能過高降低抗體濃度。
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與受質過度培育嘗試縮短培育時間,以防止訊號過度顯色。
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在有光照的情況下進行受質培育添加受質後,需立即將孔盤置於暗處。
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重複使用孔盤請使用新的孔盤。
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舊的受質緩衝液使用新鮮的受質試劑。
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負控制組污染可能被其他樣本或試劑污染。防止樣品孔間發生溢流。進行上樣時需謹慎小心。
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孔盤的洗滌不充分確保盤上樣品孔被洗滌緩衝液充滿,並確保已完全除去每個樣品孔中的殘留溶液。可增加洗滌次數。
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波長不正確確認用於測量訊號的波長設置是否正確。
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受質溶液培育時間不足將培育時間最適化,直至孔盤顯色程度足以被ELISA讀值機讀取。
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抗體用量不足嘗試使用濃度更高的抗體。抗體培育時請採用建議的培育時間。
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目標蛋白質沒有表現於樣本中搜索與目標蛋白質表現圖譜相關的資訊。增加樣本量或使用更為靈敏的檢測試劑。
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移液誤差 (Pipetting error)仔細進行上樣,避免樣品孔中出現氣泡。
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塗布不均檢查塗佈過程,選用使用適當的ELISA孔盤。
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洗滌不足使用 PBS 輕柔地洗滌切片。不要長時間浸泡在洗滌緩衝液中,或置入蒸餾水中。
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樣本固定過程使抗原決定位置受到破壞嘗試不同的樣本固定方法,如福馬林或戊二醛。甲醇可能導致細胞膜破裂。
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細胞穿透性差使用 0.1% Triton X-100 處理 15 分鐘,以提高細胞穿透性,或延長培育時間。
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二抗存放於有光處將二抗儲存在暗處。
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二抗用量不足確保二抗對一抗的特異性。
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阻隔過強縮短阻隔時間。
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太少細胞進行蛋白表現嘗試使用更多細胞或使用穩定轉染的細胞株。
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細胞沒有表現蛋白製備細胞萃取液,用西方墨點法 (Western blot) 確認目標蛋白是否存在。
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抗體培育時間過短延長培育時間。
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抗體濃度稀釋過度建議採用更高的抗體濃度。
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樣本洗滌不充分每個步驟結束時,用 PBS 徹底洗滌 5 分鐘。重複此過程 5 次。
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培養溫度過高樣本在4℃下進行隔夜培養,或置於室溫下培育 4 小時。
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二抗沒有專一性性檢查二抗的專一性結合情況。設置不含一抗的二抗對照組。
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培育時間過長縮短一抗/二抗的培育時間。
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一抗濃度過高稀釋抗體濃度
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使用錯誤的阻隔緩衝液嘗試使用不同的阻隔緩衝液,如使用PBS製備的5%山羊血清進行培育1小時。
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測試樣本固定過度縮短固定時間。
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